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重組膠原蛋白：凱氏定氮、高效液相色譜雙法解疑
前言 最近，知名美妝護(hù)膚品牌卷入成分爭(zhēng)議風(fēng)波。有博主質(zhì)疑稱該品牌一款重組膠原蛋白精華的產(chǎn)品涉嫌造假，重組膠原蛋白真實(shí)添加量為0.0177%，且未檢測(cè)出膠原蛋白的核心氨基酸成分——甘氨酸。該公司聲明，產(chǎn)品成分標(biāo)注均按法定標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行并通過(guò)藥監(jiān)部門(mén)審核備案，不存在任何成分造假或隱瞞行為。雙方爭(zhēng)論的核心還在于檢測(cè)方法的不同。 重組膠原蛋白作為生物醫(yī)藥與護(hù)膚領(lǐng)域的高效活性原料，其真蛋白含量直接決定產(chǎn)品的功效與質(zhì)量，且氨基酸作為基本組成單元構(gòu)成重組膠原蛋白的鏈狀結(jié)構(gòu)，其特定序列與修飾（如羥脯氨酸）直接決定其三螺旋穩(wěn)定性及生物學(xué)功能。本文使用“凱氏定氮法"檢測(cè)重組膠原蛋白中的總氮、非蛋白氮及真蛋白含量，并使用“高效液相色譜法"檢測(cè)重組膠原蛋白中的氨基酸含量，為廣大生產(chǎn)企業(yè)、第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)及監(jiān)管部門(mén)提供支持。 凱氏定氮法 根據(jù)《YY/T 1947-2025 重組膠原蛋白敷料》中要求，重組膠原蛋白含量可按照《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版 四部)通則0731蛋白質(zhì)含量測(cè)定法的“凱氏定氮法"進(jìn)行測(cè)定，采用鎢酸鈉沉降法沉淀樣品中的蛋白質(zhì)，通過(guò)差減法減去樣品中非蛋白氮含量，從而得到真蛋白含量。 實(shí)驗(yàn)方案 儀器 海能K1160全自動(dòng)凱氏定氮儀、SH420F石墨消解儀、分析天平等。 試劑 甲基紅、溴甲酚綠、硼酸、氫氧化鈉、無(wú)水硫酸鉀、五水合硫酸銅、濃硫酸、鎢酸鈉。 樣品 重組膠原蛋白修復(fù)液。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程 試劑配制完成后，進(jìn)行樣品稱量。 樣品稱量 1、總氮含量測(cè)試：通過(guò)減量法準(zhǔn)確稱取樣品5 g左右（精確至0.1 mg），并轉(zhuǎn)移至潔凈的消化管中。 2、非蛋白氮含量測(cè)試：通過(guò)減量法準(zhǔn)確稱取樣品5 g左右（精確至0.1 mg），置于20 mL容量瓶中，加入10 mL的純水、2 mL的10%鎢酸鈉溶液和2 mL的0.33 mol/L硫酸溶液，加水定容至刻度。搖勻，靜置30分鐘后，于3000 rpm下離心5 min以促進(jìn)樣品過(guò)濾。隨后取上清液進(jìn)行過(guò)濾，棄去初濾液（約5滴），取續(xù)濾液，使用10 mL移液管準(zhǔn)確量取10 mL濾液于消化管中待測(cè)?？瞻紫苤袆t需加入8 mL的純水、1 mL的10%鎢酸鈉溶液和1 mL的0.33 mo1/L硫酸溶液。 消解 向空白及樣品消化管中加入0.2 g硫酸銅、3 g硫酸鉀和10 mL濃硫酸后上機(jī)消解。消解程序如表1： 表1 SH420F石墨消解儀消解程序設(shè)置 階梯 溫度梯度/℃ 保溫時(shí)間/min 1 220 20 2 420 90 蒸餾與滴定 待消解程序完成，消化管冷卻并無(wú)酸霧后，使用凱氏定氮儀進(jìn)行檢測(cè)，定氮儀參數(shù)設(shè)置如表2： 表2 K1160全自動(dòng)凱氏定氮儀試驗(yàn)參數(shù)設(shè)置 滴定酸 (H+) mol/L 0.0207 硼酸/mL 30 氫氧化鈉/mL 40 稀釋水/mL 40 蒸餾時(shí)間/min 5 測(cè)試結(jié)果 樣品經(jīng)消解和上機(jī)測(cè)試，重組膠原蛋白產(chǎn)品中總氮、非蛋白氮及真蛋白含量如表3至表5所示： 表3 樣品中總氮含量表 樣品 名稱 稱樣量 /g 空白體積 /mL 滴定體積 /mL 氮含量 （mg/g） 氮含量均值 （mg/g） 修復(fù)液 5.0482 0.1949 5.9730 0.3317 0.3348 5.0104 6.0374 0.3379 表4 樣品中非蛋白氮含量表 樣品 名稱 稱樣量 /g 空白體積 /mL 滴定體積 /mL 非蛋白 氮含量 （mg/g） 非蛋白氮 含量均值 （mg/g） 修復(fù)液 5.1384 0.2035 1.2107 0.1136 0.1118 5.0509 1.1622 0.1100 表5 樣品中真蛋白含量表 樣品 名稱 總氮含量 （mg/g） 非蛋白氮含量 （mg/g） 真蛋白含量 （mg/g） 修復(fù)液 0.3348 0.1118 1.1306 注：表中真蛋白含量=（樣品總氮含量-非蛋白氮含量）×蛋白轉(zhuǎn)換系數(shù)（5.07）。 結(jié)論 經(jīng)測(cè)試，重組膠原蛋白產(chǎn)品中的總氮、非蛋白氮和真蛋白含量分別為0.3348 mg/g、0.1118 mg/g和1.1306 mg/g。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，凱氏定氮儀可用于檢測(cè)重組膠原蛋白產(chǎn)品中的真蛋白含量。 高效液相色譜法 高效液相色譜法檢測(cè)氨基酸時(shí)，因氨基酸自身無(wú)紫外吸收基團(tuán)，需借助異硫氰酸苯酯（PITC）、鄰苯二甲醛（OPA）、丹磺酰氯（DNSCl）、2,4-二硝基氟苯（DNFB）等柱前衍生試劑引入生色基團(tuán)，使衍生物具備紫外吸收特性以便被檢測(cè)。異硫氰苯酯（PITC）作為氨基酸分析中的經(jīng)典柱前衍生試劑，通過(guò)與氨基酸的α-氨基特異性反應(yīng)生成穩(wěn)定的苯基硫代氨基甲酰（PTC）衍生物，該衍生物具有強(qiáng)紫外吸收特性（λmax=254nm），可顯著提升檢測(cè)靈敏度至皮摩爾級(jí)，同時(shí)其反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物穩(wěn)定性高且能兼容多數(shù)氨基酸（包括含羥基或含硫氨基酸），使其在高效液相色譜分析中成為兼顧靈敏度、選擇性與操作便捷性的理想選擇。本實(shí)驗(yàn)采用PITC柱前衍生-高效液相色譜法檢測(cè)重組膠原蛋白中的16種氨基酸。 實(shí)驗(yàn)方案 儀器配置 悟空K2025高效液相色譜儀：K2025 P2二元高壓輸液泵、K2025 AS自動(dòng)進(jìn)樣器、K2025 CO柱溫箱、K2025 UVD紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器、Wookinglab色譜工作站。 色譜條件： 色譜柱：JinGuBang AAA ，4.6×250 mm，5 μm； 流動(dòng)相：流動(dòng)相A為0.05 mol/L乙酸鈉水溶液，流動(dòng)相B為甲醇-乙腈-水=1:3:1，梯度洗脫如下表： 時(shí)間 （min） 流速 （mL/min） 流動(dòng)相A （%） 流動(dòng)相B （%） 0.0 1.0 95 5 39.0 1.0 52 48 40.0 1.0 0 100 45.0 1.0 0 100 46.0 1.0 95 5 60.0 1.0 95 5 進(jìn)樣量：20 μL； 洗針液：90%甲醇水溶液； 柱溫：40℃； 檢測(cè)器及檢測(cè)波長(zhǎng)：檢測(cè)器為紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、線性范圍結(jié)果 按照色譜條件進(jìn)行采集，16種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1所示，積分結(jié)果如表1所示。 圖1 16種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖 表1 16種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖積分結(jié)果 由表1中數(shù)據(jù)可知，16種氨基酸峰的理論塔板數(shù)范圍為12333~397824，分離度范圍為1.14~29.62，均可實(shí)現(xiàn)較好分離。 按照色譜條件進(jìn)行采集，將16種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測(cè)定，16種氨基酸在0.0625 μmol/mL~1.25 μmol/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，確定系數(shù)R2的范圍為0.9976 ~0.9999 。16種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液疊加的色譜圖如圖2所示。 圖2 16種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液疊加色譜圖 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)采用PITC柱前衍生-高效液相色譜法成功實(shí)現(xiàn)了重組膠原蛋白中16種氨基酸的檢測(cè)。 膠原蛋白含量的檢測(cè)方法多樣，具體選擇取決于樣本類(lèi)型、設(shè)備條件等，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件和需求選擇合適方法，必要時(shí)可結(jié)合多種技術(shù)驗(yàn)證結(jié)果。
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